实验一 蛋白质定量测定

溶液中蛋白质可根据其理化性质用化学法、染色法、荧光激发、同位素计数等方法测定，其中尤以紫外分光光度法、考马斯亮蓝染色法、双缩脲法和酚试剂法最为实用，操作方法简便、不需要昂贵仪器设备。

一、紫外分光光度法

  （一）原理

蛋白质分子中常含酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等芳香核结构，在紫外280nm波长处有最大吸收峰，故可用280nm波长的吸光度大小来测定蛋白质的含量。

本法对微量蛋白质的测定（测定蛋白质浓度范围为0.1~1.0g/L）操作简便、快速，不需要其他试剂，测定样品可以回收，样品中混有(NH₄)₂SO₄或其他盐类也不干扰测定。

样品中若混有核酸或核苷酸时，由于核酸在280nm波长处也有光吸收，对蛋白质的测定有干扰作用，但核酸的最大吸收峰在260nm处，如同时测定260nm的光吸收，通过经验公式计算可以消除其对蛋白质测定的影响。另外，测定的样品蛋白质中酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸含量的差异也会对测定结果产生一定的影响。

（二）器材

751型（752型）紫外分光光度计

（三）试剂

1、 生理盐水

2、 稀释血清 准确吸取血清0.1ml，置50ml容量瓶中，用生理盐水稀释至刻度。

  （四）操作

  1、用751型紫外分光光度计分别测定稀释血清的A₂₈₀和A₂₆₀值（用光径1cm的石英比色杯盛稀释血清，以生理盐水为空白对照），记录读数。

  2、按下列经验公式计算蛋白质浓度

蛋白质浓度（g/L）=1.45A₂₈₀-0.74A₂₆₀

二、双缩脲法

  （一）原理

蛋白质分子中的肽键结构在碱性溶液中能与Cu²⁺络合生成紫红色络合物。该反应机制与双缩脲（二分子尿素缩合生成）在碱性溶液中与Cu²⁺作用形成紫红色物质相似，故把蛋白质的这一呈色反应称为蛋白质的双缩脲反应，且颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，可在540nm波长比色测定。本法操作简便、迅速，受蛋白质特异性影响较小，但灵敏度较差（测定蛋白质浓度范围为0.5~10g/L），并受NH₄⁺、硫醇以及具有肽类性质的缓冲液如Tris等的干扰。

（一）   器材

  1、721型分光光度计

  2、容量瓶

3、 刻度吸管

4、 试管及试管架

5、 水浴

（二）   试剂

  1、双缩脲试剂 取硫酸铜（CuSO₄·5H₂O,CP）1.5g和酒石酸钾钠（NaKC₄H₄O₆·4H₂O,CP）60g以少量蒸馏水溶解，再加10%（w/v）NaOH溶液300ml，碘化钾（KI）1.0g，然后加水至1000ml，置棕色瓶内，避光，可长期保存。如果该试剂中出现暗红色沉淀则不能再使用。

  2、蛋白质标准液（1g/L）称取试剂级冻干牛血清清蛋白100mg，用生理盐水溶解，然后稀释至100ml。该溶液应避免剧烈振摇起泡。

  3、生理盐水

  （四）操作

  1、标准曲线绘制 取试管7支，编号，按下表操作：

混匀各管，置37℃水浴30分钟，在540mm波长处以1号管调零点，测定其余各管吸光度，以吸光度为纵座标，蛋白质含量为横座标绘制标准曲线。

2、样品测定 取血清0.1ml于试管内，加生理盐水2.9ml、双缩脲试剂3.0ml，混匀，置37℃水浴30分钟，测其540nm的吸光度，对照标准曲线求得血清蛋白质浓度。

三、酚 试 剂 法

（一）   原理

酚试剂的主要成份是磷钼酸—磷钨酸的混合液。蛋白质中所含酪氨酸和色氨酸等残基在碱性条件下与酚试剂反应生成钼蓝及钨蓝的混合物而显蓝色，蓝色的深浅与蛋白质浓度成正比，这是本法测定蛋白质含量的依据。

本法测定蛋白质浓度范围为10~60mg/L，较双缩脲法灵敏约100倍，适用于脑脊液、血清蛋白质测定。本法缺点是各种蛋白质的酪氨酸残基含率不同，显色强度也不同。因此需使用同种蛋白质标准。酚类、巯基化合物、糖类等化合物对本法有干扰。

（二）器材

1、 试管及试管架

2、 刻度吸管

3、 721型分光光度计

（三）试剂

  1、牛血清清蛋白标准液(0.25g/L)将lg/L牛血清清蛋白液（配法见“双缩脲法”实验）以生理盐水稀释至0.25g/L即得。

  2、酚试剂的配制（均用分析纯试剂）

试剂甲：由下述三种溶液混合而成：①无水碳酸钠20g，氢氧化钠4g，溶于1000ml蒸馏水中；②硫酸酮（CuSO₄·5H₂O）0.2g溶于20ml蒸馏水中；③酒石酸钾钠（或酒石酸钾、酒石酸钠）0.4g溶于20ml蒸馏水中。将①液100ml和②液、③液各1ml混合即试剂甲，混合后放置30分钟使用，当天使用有效，而单独的三种试剂均可长期保存。

试剂乙（又名酚试剂）：于1500ml圆底烧瓶内加入钨酸钠（Na₂WO₄·2H₂O）100g，钼酸钠（Na₂M_OO₄·2H₂O）25g，蒸馏水700ml，85%磷酸50ml及浓HCl 100ml，烧瓶上接冷凝装置，缓慢加热回流10小时，再加硫酸锂(Li₂SO₄·H₂O)150g及蒸馏水50ml（必要时过滤），如溶液显绿色，可加溴水数滴使溶液呈淡黄色。然后开口煮沸15分钟以除去多余的溴，冷却后稀释至1000ml，此为贮存液，于棕色瓶中保存。使用时用等量蒸馏水稀释之。

（四）操作

1、以0.1ml微量吸管吸取血清0.1ml，拭净外壁后缓缓放入50ml容量瓶中，加生理盐水至刻度，混匀备用。

1、 取试管3支，编号，按下表操作

混匀，室温放置10分钟，各管再加试剂乙0.25ml，30分钟后测650nm处吸光度。

3、计算：

蛋白质含量（g/L）=